佛手多糖的分离纯化及抗氧化活性研究.pdf

庄培荣

苦瓜作为一种含有多种营养物质的药食一体的植物，常被用以治疗上火导致的咽喉肿痛、眼痛以及糖尿病等疾病。在苦瓜中富含各种微量元素以及以及氨基酸等人体必备的物质，国内外各项研究表明苦瓜具有降糖降脂、抗病毒、抗肿瘤以及调整免疫能力等多项生理功能，并力图对其作用成分进行分析，但并未取得明显的成效。多糖作为苦瓜中含有的一项重要活性成分之一，与苦瓜的生理作用势必具有不可分割的联系。由此对苦瓜中多糖的分析成为了科学界炙手可热的研究课题，但由于多糖结构复杂，因此相关研究仍然处于不完整的状态。针对这一现状，本文对苦瓜多糖的分离纯化方法以及其抗氧化性进行了简要的研究，以期对苦瓜多糖的相关研究起到一定的参考作用。

实验所需材料与仪器

苦瓜多糖粗产品。苦瓜多糖粗产品指的是采用改良的水提法初步从苦瓜中将多糖进行分离所得出的苦瓜粗多糖。本文所分析的实践过程即是在这一产品上进行的。

各种实验所需试剂。要对苦瓜中的多糖进行分离纯化，就需要借助相关的试剂进行。这些试剂包含：自制DNS试剂组以及DEAE-cellulose DE52羟甲基纤维素填料、Sephadex G-75 葡萄糖凝胶填料、二苯基苦基苯肼、三氨基甲烷盐酸盐等，这些试剂均能对实验起到重要的辅助作用。

实验所需仪器。在苦瓜多糖的分离纯化以及抗氧化性分析实验的过程中除了需要用到试管烧杯等一些常用的实验仪器之外，还需要用到紫外可见分光光度计。这一仪器主要用于观测光密度（OD值），从而反应分子分布情况，辅助实验结果观测。

实验所用方法

DEAE-cellulose DE52柱分离法。这一方法指的是将准备好的苦瓜粗多糖产品置于固定体积的玻璃柱中，利用蒸馏水将样品进行溶解，再使用DEAE-cellulose DE52柱对样品进行层析分离。接着用蒸馏水以及不同含量的NACL溶液对样本进行洗脱，流速控制为每分钟0.8ml，每5ml进行一次收集，继而利用上文所提到的紫外可见分光光度计在486nm时进行OD值的观测，并制作相应曲线图，继而根据曲线图收集多糖吸收峰值部分的溶液，冷冻干燥得到分离组分。

Sephadex G-75 纯化法。将利用上文所述柱分离法进行分离过的样本进行进一步的处理，将其置于玻璃柱中，利用蒸馏水将其进行溶解。接着用试剂中的Sephadex G-75 葡萄糖凝胶填料对其进行进一步分离纯化之后以每小时4ml的速度利用蒸馏水进行洗脱，每2ml收集一管，同样在486nm时进行OD值观测，并作出曲线图。

多糖分子量分布测定法。要想直接观测多糖的分离纯化情况就应当对其分子量分布情况进行观测。这一方法主要是采用0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液作为流动相，并将其与分离纯化之后的样品进行融合，在将混合液进行高速离心之后，对其上清液进行采集，并利用微孔滤膜对其进行过滤，经过GPC软件处理之后得出样品的分子分布量情况。

清除率计算法。本文所述的对苦瓜多糖的抗氧化性的研究主要通过其对DPPH.无水乙醇以及对超氧阴离子自由基的清除率进行反应。在对DPPH.无水乙醇清除率进行检验的时候主要采用的是在其中加入苦瓜多糖溶液再注入无水乙醇进行体积填补，而后静置观察的方法并在517nm处测试吸光度。而超氧阴离子自由基的清除率的实验就相对复杂，需要先取用0.03mol/L的三氨基甲烷盐酸盐作为缓冲液，对其先进行预热，而后加入0.05mg/ml的苦瓜多糖溶液以及0.25mol/L的邻苯三酚溶液混合均匀后再进行水浴，最后用HCL终止反应，在299nm处测试吸光度。虽然二者的实验过程复杂程度不同，但是其均利用空白溶液作为对照组，且使用的清除率计算公式均为P=（A-B）/A*100% （A、B均为吸光度，A为对照组、B为样本组）。

实验结果

分离纯化结果。在DEAE-cellulose DE52柱分离法中，蒸馏水洗脱之后未出现明显峰值，也就是说中性多糖含量低，而用氯化钠溶液洗脱后得出4个洗脱峰，将其收集并冷冻干燥后，有一组回收率低，因此只选用余下三组利用Sephadex G-75 纯化法继续进行分离纯化，出现明显洗脱峰，再利用DNS試剂进行纯度测试，发现其纯度达到96%，较分离纯化之前的74%有显著提升。由此可见分离纯化效果明显。

分子量分布结果。在分离纯化之前，分子量集中在分隔较远的两个部分，而在进行分离纯化操作之后集聚在33000Da这一部分，由此可见，经过分离纯化之后，苦瓜多糖中的大分子物质以及杂质都得到了减少，进一步证实了纯化过程的有效性。

清除率实验结果。在清除率实验中，实验结果显示，在多糖量达到0.65mg的时候对DPPH.无水乙醇的清除率达到了90%，而在清除超氧阴离子自由基时，其浓度达到0.7mg清除率就达到了100%。且随着浓度的增加效果不断显著。但是在这一峰值之后再增加浓度其效果变化不如达到峰值前显著，由此可见苦瓜多糖抗氧化效果显著但具有一定的最适值。

结合上文的实验研究可知，利用DEAE-cellulose DE52柱分离法以及Sephadex G-75 纯化法对苦瓜多糖进行分离纯化效果显著。再结合其清除率可以得知苦瓜多糖的抗氧化效果极佳，但具有效益最大的峰值浓度。因此在往后的苦瓜多糖研究过程中应当更趋向于其最佳效果值的分析，以使其取得最大的科学效益以及经济效益。