食源沙门菌DNA环介导恒温核酸扩增法检测

仇红萍

沙门菌能够引起严重的食物中毒，是一种人畜共患的病原菌，该类型细菌的疫病爆发以及流行已经受到了人类广泛的关注，针对沙门菌的检验方式更为先进，操作也更为简便。传统的检测方式一般以分离培养为主，结果较为准确，但是操作步骤繁琐，而且免疫学的敏感度较低，生物学的聚合酶链反应（简称PCR）等敏感度较高，但需要更为先进的设备，因此很难得到大范围推广应用。LAMP，即环介导等温扩增法，采用新型的方式对核酸进行扩增，操作简单、特异性强，相对于其它方式，效果十分显著。

材料与方法

一般材料

2016年7至9月选择125份食品样本，包括冷冻生肉16份，生鲜肉16份，熟肉16份，非发酵类豆制品16份，米面16份，生水产品9份，冰淇淋9份，蔬菜沙拉9份，新鲜果汁9份，生食蔬菜9份。

阳性控制菌株：肠炎沙门菌。

检测方式

样本前增菌。根据《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》中相关标准，取25克标本，添加到无菌均质袋里，均匀拍打两分钟，在37℃的条件下培养8至10小时。冷冻产品需要在45℃下进行不超过15分钟的解冻。

分离培养法。轻柔晃动样本前增菌液，然后从增菌后的290份样本中选取1毫升，将其放入10毫升TTB增菌液中，在42℃下培养18至24小时。另外，再取1毫升放置于10毫升SC增菌液中，在37℃下培养18至14小时。再取1毫升食品标准增菌液，接种在BS平板以及XLD平板上，在37℃下培养18至24小时。选取3个可疑的菌落，分别接种在TSI、赖氨酸脱羟酶试验培养基、琼脂平板上，在37℃下培养18至24小时。一定时间的生化反应后，选取其中与沙门氏菌基本符合的，基于琼脂平板上获取可疑的菌落，与生理盐水混合制备成浑浊度适当的菌悬液，利用微生物系统进行自动鉴定。若BS与XLD平板上没有出现可疑菌落，则将BS平板继续置于37℃的环境中继续培养18至24小时。若结果仍然没有可疑菌落，则判定为阴性。若实际情况需要，可以进行血清学分型。

LAMP检测方式。获取食品标本前增菌液1毫升，以每分钟10000r的速率进行离心，两分钟后停止，将上清液去除，利用核算提取试剂盒将下层核算取出。同时，另外取出1微升上清液，将待验模板DNA制作出来。根据沙门氏菌检验标准设计出引物，检验125份标本的DNA，将标准反应体系作为判断指标。在65℃条件、80℃灭活酶下，持续60分钟的水浴。反应结束后，观察反应液，如颜色呈现绿色，则为阳性，若为无色或棕色，则为阴性。鉴定方式还可以采用电泳方式，阳性为最小片段大于100bp的特征性梯状。

统计学方式

利用SPSS15.0软件帮助分析，计数资料利用χ2检验，差异用P<0.05表示。

结果分析

经过检验结果的对比分析，LAMP的阳性率为11.2%，分离培养法为5.6%，该比较具有统计学意义（P<0.05）。如表1：

讨论

沙门菌具有多种类型，能够对人、家畜、野生禽兽等产生不同形式的感染。感染沙门菌的人以及带菌者的粪便如果对食品造成污染，就会引起严重的事物中毒现象。沙门氏菌在能够引起食物中毒的细菌中常列榜首。环介导等温扩增法，简称LAMP，采用新型方式对核算进行扩增，在靶基因的六个区域内，设置四种特异引物，在链置换DNA聚合酶的帮助下，将65℃保持30至60分钟，完成扩增。相较于常规的聚合酶链反应（PCR），模板无需进行热变形、温度循环等过程，因此操作程序简化了许多，也能快速得到结果，特异性也比较强。LAMP的灵敏度也比PCR高，检测范围也得到了一定的扩宽，检测结果用肉眼即可观察到，在食品检测中具有很高的应用价值。陆续有专家对LAMP检测方式进行了一系列探讨。袁发浒、黄金海、李雪、田桢干等专家对LAMP检测步骤的建立、检测的应用等进行了深入的研究。通过他们的实践，结合近年来的理论研究再一次证明了LAMP的检测结果高于国际通过方法，由此可见，该方式更为快速，结果更为精确。

虽然细菌分离培养的方式现阶段的应用仍然比较广泛，但是其操作程序比较复杂，需要经过前增菌、分离、生化等诸多步骤，得到阴性检测结果通常需要大约4天的时间，检测沙门氏菌时利用该方式得出结果至少需要七天的时间，因此在急需检测结果的时候就不能使用了。另外，细菌的分离需要进行两次增菌后才能继续分离培养的方式，生化鉴定的程序十分復杂繁琐，并需要借助于微生物鉴定系统，经常出现血清分型价效低的问题，所用到的试剂不仅价格高，而且容易失效，鉴定所需要的机械设备也十分昂贵，不能广泛推广使用。LAMP方法在提取出核酸之后就能直接扩增，一个小时后即可完成扩增过程，经过24小时即可得出检测结果，肉眼直接就能观察，更加方便、快捷、直观。本文将LAMP检测与细菌分离检测的方式进行对比，对125份食品样本中的沙门菌进行检测。通过对结果的分析表明，这两种方式的检测结果中阳性率存在十分显著的差异，LAMP的阳性率为11.2%，细菌分离培养为5.6%，前者显著高于后者。

结语

由以上研究的结果对比可知，在食品沙门氏菌检验中应用LAMP方式，操作更加简便，结果也更能快速得到，结果更加精确，相较于细菌分离培养方式具有显著的优点，能够进行食品卫生的初步检验。但是该方式只能检测沙门氏菌的通用核酸，不能鉴定分型与分离菌株，因此可以将LAMP方式与分离培养法配合进行。