...2010T明胶中牛羊猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法.pdf

刘敏 黄小凯 胡秀红

肉类源性成分鉴定的方法多种多样，国内外在基因水平上对肉类源性成分进行鉴定的方法也越来越多。但是定性方法只能证明样品中含有某种源性的肉类而不能证明不含有其他种类的肉类。而且对于肉类掺杂的比例的确定，在标准上还是一片空白。因此，建立一个方法去甄别肉类食品的轻微污染与故意掺假显得十分重要。本文主要对实时荧光定量PCR定量检测肉制品中牛/羊/猪源性成分的方法进行研究。

试验部分

试剂耗材。DNA提取试剂盒。

Taq PCR Master MIX。

DNA标准品。

DNA引物和探针。

仪器设备。实时荧光定量PCR仪。

样品DNA提取。通过从提取效果、提取时间、提取成本等各个方面考虑，最终选择了试剂盒法。

标准曲线。动物源性和牛/羊/猪源性：每个run设置标准曲线5个反应、阴性控制1个反应、阳性控制2个反应，每个样本DNA至少2个反应。

DNA标准品的起始拷贝数为1，000，000，通过用Buffer EB进行稀释，稀释至浓度分别为100，000、10，000、1，000、100、10copies/μl。

每个校正点用2μl的标准DNA。将每个反应的拷贝数量都记录在实时荧光定量PCR仪的分析软件中，根据检测到的荧光得到Ct值，从而得出标准曲线。

PCR体系。PCR扩增体系中包含Taq PCR Master MIX 12μL，模板DNA2μL，上下游引物2μL，探针 1μL，加水至25μL。在该体系下，PCR扩增曲线明显，能达到定量的要求。

PCR程序。本实验室采用罗氏LC96，以下所列的PCR程序效果比较好。预变性90s，95℃，变性5sec， 95℃，退火10sec， 62℃，延伸15sec， 65℃，循环数为45。荧光通道的选择FAM，在延伸阶段收集荧光。

结果与讨论

线性范围、线性方程、相关系数。通过实验获得结果进行数据分析，三种化合物在20～200000拷贝数范围内线性关系良好，相关系数均大于0.97。其中各种源性线性如下：

检出限、精密度和回收率。20和200，000起始拷贝数的标准物质的扩增曲线明显，阴性对照无明显扩增曲线，仪器的检出限可以达到0.01%。结合实际样品及DNA提取等因素，本方法的检出限可以达到1%。

按照重量配比，在不含目标源性混合肉中分别掺入1%（w/w）、10%（w/w）和50%（w/w）的目标源性肉类，再取一个纯肉样品，分别进行6个平行的测定，获得6个平行的实测数值。

通过计算检出限为1%，精密度小于10%和回收率在85%- 110%之间。

本方法建立了牛/羊/猪源性成分的定量曲線，实现了肉制品中牛/羊/猪源性的相对定量，通过优化实验步骤和方法，使得检测时间短、精度较高、稳定性较好。该方法也为制定相关检测方法标准提供参考。

基金项目：温州市科技局立项项目（基金编号为S20150025）