米面制品中蜡样芽胞杆菌平板计数法的不确定度评定-惊人的相似度啊

薛丽芝

需氧性芽胞杆菌引起的食物中毒早在1906年就有报告（Lubenau）。但直至1950年始，方明确吃甜食后引起蜡样芽胞杆菌所致的食物中毒腹泻。在国内，1973年首次报告了南京某托儿所儿童因进食泡饭引起的呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒。目前，蜡样芽孢杆菌所引起的食物中毒在我国细菌性食物中毒中位居前3位。

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种需氧、能形成芽胞的革兰氏阳性粗杆菌。该菌在自然界中分布广泛，污染食品机会较多。蜡样芽胞杆菌食物中毒所涉及的食品种类繁多，包括乳制品、禽畜肉类制品、蔬菜、汤汁、马铃薯泥、豆芽、甜点心、调味汁、色拉和米饭等。而在我國引起中毒的食品大多与米饭或淀粉类制品有关。蜡样芽胞杆菌引发中毒的食品除米饭微有发粘和略带异味外，一般均无腐败变质现象，所以不易被发现。此外，蜡样芽胞杆菌造成的食物中毒存在明显的季节性，以夏秋季（6～10月）为最多。

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，是与测量结果相联系的参数，在化学分析中应用较多，但在微生物检验中应用并不多。随着食品微生物学的发展，食品中微生物限量指标是评价食品质量的重要指标之一。食用食品中含蜡样芽胞杆菌达105个以上时就可引起食物中毒。在现行食品安全国家标准中许多微生物指标要求检测结果为定量报告，如蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌等，而蜡样芽胞杆菌的计数存在很大的分散性，故做好蜡样芽胞杆菌计数不确定度的评定非常重要，也对实验室提出了更高的要求。

因此，本研究依据《GB4789.14- 2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》对市售20个米面制品制品进行蜡样芽胞杆菌的测定，将测定结果取对数后，依据《CNAS- GL05测量不确定度要求的实施指南》用合并样本标准差求蜡样芽胞杆菌的测定结果的不确定度，进而说明合并样本标准差法评定食品微生物学检验中蜡样芽胞杆菌检验结果不确定度是否合适。

检验方法和材料

检验方法。依据《GB4789.14- 2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）进行检验，程序见图1。

检验样品。本次样品均为市售米面制品制品，并含可计算得出数目的蜡样芽胞杆菌固体样品，总件数为20件。

检验材料。本次检验均采用《GB4789.14- 2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》所指定的培养基和器材。

检验过程。以无菌操作取一米面制品样品25g剪碎放于225ml灭菌生理盐水中，经均质器10000r/min均质1min，做成1： 10稀释样液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管。选择3个稀释度，分别做10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入3块MYP平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，30℃±1℃恒温培养箱内培养24h，如果菌落不典型，继续培养24h再观察，计数。在MYP 琼脂平板上，典型菌落为微粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有白色至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）。

结果计算。从平板上挑取5个典型菌落（小于5个全选）进行验证试验。根据 MYP 平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按照公式（1）计算，最后得出样品中蜡样芽胞杆菌菌落数CFU/g。

公式（1）中：T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数，CFU/g

A——MYP平皿蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数，个

B——验证试验确定的蜡样芽胞杆菌的菌落数，个

C——用于验证试验的蜡样芽胞杆菌菌落数，个

d——稀释因子

不确定度评定

在食品微生物检验中，样品中细菌分布的均匀性和重复测量带来的不确定度是影响检验结果准确度的主要原因，而B类不确定度分量对合成不确定度影响较少，所以按照《GB4789.14- 2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》操作程序，同一样品每个稀释度做两个平行样，可以采用合并样品标准差求检测结果的不确定度。

由实验室内相同人员对该类米面制品制品20个样品在短时间内按《GB4789.14- 2014食品安全国家标准食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》 进行检验，每个样品做2个平行样，得到的检验结果及对数值（见表1）。

根据贝塞尔公式，可计算出合并样本的标准偏差：

结果报告

例如4#样品在MYP平皿上蜡样芽胞杆菌计数平行双样结果分别为43个和46个，稀释倍数为100倍，计算出其对数平均值为3.648，所以该样品蜡样芽胞杆菌菌落总数的对数值为3.648±0.034，取反对数，其结果分布于4111～4808之间，所以该样品蜡样芽胞杆菌菌落总数为4.1×103～4.8×103 cfu/g。例如13#样品在MYP平皿上蜡样芽胞杆菌计数平行双样结果分别为28个和31个，稀释倍数为100倍，计算出其对数平均值为3.469，所以该样品蜡样芽胞杆菌菌落总数的对数值为 3.469±0.034，取反对数，其结果分布于2723～3184之间，所以该样品蜡样芽胞杆菌菌落总数为2.7×103～3.2×103 cfu/g。例如14#样品在MYP平皿上蜡样芽胞杆菌计数平行双样结果分别为53个和52个，稀释倍数为10倍，计算出其对数平均值为2.720，所以该样品蜡样芽胞杆菌菌落总数的对数值为 2.720±0.034，取反对数，其结果分布于485～568之间，所以该样品蜡样芽胞杆菌菌落总数为2.7×103～3.2×103 cfu/g。

讨论

从以上计算结果可知，由于检验结果的散发性较大，如直接用贝塞尔公式计算合并样本标准差所得到的不确定度不适合每一个样本。当检验结果取对数后，用合并样本标准差求检验结果的不确定度则使用方便，并且适合于每一个样本。 随着检验结果的不断增加，可随时加入到合并样本中，重新计算合并样本标准差，更新其不确定度的取值范围。

本实验不确定度的来源可能还有培养时间，培养温度，刻度吸管的不确定度等，不确定度因素来源具体分析：

（1）称量，天平经检定合格，本次不涉及；

（2）培养时间，在正常规定范围内，不影响；

（3）培养温度，经校正，波幅在正常范围内，不影响；

（4）环境温度、湿度，在正常在范围内，不影响；

（5）同一人员多次操作，每次操作可能存在的小误差；

（6）移液器经检定合格，但取样时外壁悬挂的液滴量，有一定小差异；

（7）平皿堆叠的厚薄不均导致可能的培养温度的不均；

本次实验过程中可能出现误差的因素，最终体现在蜡样芽胞杆菌菌落数的计数上，最终计数的蜡样芽胞杆菌菌落数已涵盖上面分析的多个不确定因素造成的误差，但这些因素对本实验不确定度影响较小，可以忽略不计。